ISOLASI DNA KROMOSOMAL BAKTERI DAN ISOLASI DNA PLASMID DENGAN METODE SPIN COLUMN

ISOLASI DNA KROMOSOMAL BAKTERI DAN ISOLASI DNA PLASMID DENGAN METODE SPIN COLUMN

Ade Puji Setyawati ¹⁾

Drh. Bhintarti  S. Hastari, M. Biomed²⁾

Festy Auliyaur Rahmah, S. Si²⁾

Nugroho Adi Maulana³⁾

Indhina Reihannisha³⁾

1)      Mahasiswa Jurusan Biologi, Fakultas Sains dan Teknologi, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta

2)      Dosen Praktikum Biologi Molekuler

3)      Asisten Praktikum Biologi Molekuler

Jl. Ir. H. Djuanda, Tangerang Selatan 15412, Indonesia

Email : Adebio12@gmail.com

Jum’at, 17 Oktober 2014

ABSTRAK

Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus yang disebut sebagai DNA kromosomal. Selain DNA kromosomal, terdapat DNA ekstrakromosomal diantaranya plasmid, mitokondria dan kloroplas. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal. Sehingga dalam praktikum ini diharapkan praktikan mampu melakukan isolasi DNA kromosomal bakteri dan isolasi DNA plasmid dengan metode spin column. Bakteri yang digunakan untuk diambil plasmidnya adalah bakteri Escherchia coli dikarenakan: Mudah didapatkan, menghasilkan keturunan yang banyak dalam waktu yang singkat dan memiliki jumlah plasmid yang banyak. Isolasi DNA kromosom memiliki prinsip, prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain. Prinsip-prinsip dari sentrifugasi adalah dengan memisahkan molekul berdasarkan ukuran dan berat molekul.

Kata kunci : DNA, Kromosom, Plasmid, Isolasi

I.            Dasar Teori

DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme (Jamilah, 2005). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999).

Setiap organisme memiliki DNA yang terletak dalam inti sel atau nukleus yang disebut sebagai DNA kromosomal. Selain DNA kromosomal, terdapat DNA ekstrakromosomal diantaranya plasmid, mitokondria dan kloroplas. Plasmid merupakan DNA ekstrakromosomal yang berbeda karakternya dengan DNA kromosomal. Bentuk plasmid adalah sirkuler double helix dengan ukuran 1 kb sampai lebih dari 200 kb. Pada bakteri jumlah plasmid yang dimiliki bervariasi bahkan sampai ribuan ataupun tidak memiliki plasmid.  

Beberapa karakteristik dari plasmid yang patut diketahui antara lain: dapat ditransfer ke bakteri lain dan memiliki ORI (Origin of replication) sehingga mampu mereplikasi diri tanpa pengaturan dari DNA kromosom. Plasmid merupakan potongan melingkar DNA yang ukuranya kecil (kurang lebih 2000 sampai 10000 pasangan basa) yang berisi informasi genetik yang penting untuk pertumbuhan bakteri.  

Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA, salah satu prinsip isolasi DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993). Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat.

Prisnsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Dolphin, 2008). Sehingga dalam praktikum ini diharapkan praktikan mampu melakukan isolasi DNA kromosomal bakteri dan isolasi DNA plasmid dengan metode spin column.

  II.     Materi

Alat yang digunakan dalam praktikum isolasi DNA kromosomal bakteri dan isolasi DNA plasmid dengan metode spin column adalah alat tulis, mikropipet, sentrifuga, vortex, waterbath, inkubator, yellow tips, blue tips, freezer, tabung mikro 1,5 steril, 2 ml collection tube, dan kamera.

Bahan yang digunakan adalah sediaan kultur bakteri Escherichia coli, EDTA 50 Mm, larutan sukrosa 25%, EDTA 0,5 M pH 8, lisozim 10 mg/ml, NaCl 5 M, SDS 20%, proteinase-K 5 mg/ml, kloroform, etanol dingin, buffer TE, buffer PD1, buffer PD2, buffer PD3, RNAse A, buffer W1, buffer Wash, etanol absolut, buffer elusi, dan PD column.

III.     Metode

Cara kerja untuk isolasi DNA kromosomal bakteri yaitu dengan mensentrifugasi kultur bakteri E. coli sebanyak 1,5 ml dengan kecepatan 4300 rpm selama 20 menit, lalu disuspensikan kembali pellet yang didapatkan dengan 60 µL EDTA 50 mM, kemudian sentrifugasi dengan kecepatan 4300 rpm selama 15 menit. Tambahkan pada pellet yang diperoleh dengan 40 µL larutan sukrosa 25 % dan 10,5 µL EDTA 0,5M pH 8. Kemudian tambahkan dengan 1,5 µL lisozim 10mg/ml dan inkubasi pada suhu 37⁰C selama 1 jam.

 Setelah itu tambahkan 18 µL NaCl 5M; 10,5 µL EDTA 0,5 M; 22,5 µL SDS 20%, dan 1,5 µLproteinase-k 5 mg/ml, kemudian divortex dan diinkubasi sediaan pada suhu 50 ⁰C selama 1 jam. Lalu ditambahkan kloroform dengan perbandingan (1:1) dan kocok pelan selama 20 menit. Selanjutnya sentrifugasi dengan kecepatan 4300 rpm selama 30 menit. Pindahkan supernatan (larutan yang terlihat bening) ke tabung baru yang berisi 2x volume etanol dingin. Setelah itu sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit.

Selanjutnya ditambahkan pellet dengan 30 µL buffer TE dan simpan pada suhu -20⁰C. Untuk mengisolasi DNA plasmid dengan menggunakan metode spin column dilakukan beberapa tahapan diantaranya tahap 1. Harvesting dengan menyiapkan 1,5 mlkultur sel bakteri E. coli dalam tabung mikro 1,5 ml kemudian disentrifuga pada 14.000-16.000 x g selama 1 menit denga tabung supernatan.

 Tahap 2 Resuspension dengan menambahkan 200 µL buffer PD1 (pastikan RNAse A telah ditambahkan) kedalam tabung mikro kemudian divortex. Tahap 3. Lysis dengan menambahkan 200 µL buffer PD2 ( pastikan pellet sudah larut dalam buffer PD1) kemudian bolak-balik tabung 10x dengan hati-hati (jangan gunakan vortex), setelah itu inkubasi dalam suhu ruang minimal 2 menit.

Tahap 4. Neutralization dengan menambahkan 300 µL buffer PD3 kemudian bolak-balik tabung 10x (jangan gunakan vortex) lalu sentrifuga pada 14.000-16.000x g selama 3 menit. Tahap 5. DNA binding dengan menempatkan PD column dalam 2ml collection tube kemudian tuang supernatant dari tahap 7, kemudian sentrifuga pada 14.000-16.000x g selama 30 detik.

Lalu buang cairan pada 2 ml collection tube, kemudian pasang kembali PD column pada 2 ml collection tube. Tahap 6. Wash dengan menambahkan 600 µL wash buffer (pastikan etanol telah ditambahkan) kedalam PD column kemudian sentrifuga pada 14.000-16.000x g selama 30 detik. Lalu buang cairan dalam 2 ml collection tube, kemudian sentrifuga pada 14.000-16.000x g selama 3 menit untuk mengeringkan PD column.

Tahap 7. DNA elution dengan menambahkan 50 µL buffer elusi ke bagian tengan PD column matrix, biarkan selama minimal 2 menit agar buffer elusi terserap sempurna, lalu sentrifuga pada 14.000-16.000 xg  selama 2 menit untuk mendapatkan DNA murni, setelah itu tuangkan kembali cairan dalam 2 ml collection tube ke bagian tengah PD column matrix dan sentrifuga pada 14.000-16.000 x g selama 2 menit untuk mendapatkan DNA murni.

IV.               Hasil dan Pembahasan

4.1              Hasil yang didapatkan dari praktikum isolasi DNA kromosomal bakteri dapat dilihat pada tabel berikut ini :

No	Gambar	Keterangan
1		Terdapat endapan putih (pellet) yang didapatkan setelah kultur bakteri disentrifugasi 4300 rpm 20 menit
2		Terdapat 2 lapisan setelah penambahan kloroform dan dikocok selama 20 menit
3		Terdapat 3 lapisan setelah di sentrifugasi 4300 rpm selama 30 menit

4.2 Hasil yang didapatkan dari praktikum isolasi DNA plasmid dengan menggunakan metode spin column dapat dilihat pada tabel berikut ini :

No	Gambar	Keterangan
1		Terdapat endapan putih (Pelet) yang didapat setelah disentrifugasi 14.000-16.000 x g selama 5 menit
2		Setelah penambahan PD3 dan disentrifuga 14.000-16.000 x g selama 3 menit

Berdasarkan hasil praktikum isolasi DNA kromosomal bakteri  Escherichia coli isolasi DNA dilakukan untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel. Isolasi DNA kromosom memiliki prinsip, prinsipnya adalah memisahkan DNA kromosom atau DNA genom dari komponen-komponen sel lain.  Setelah kultur bakteri disentrifugasi dengan kecepatan 4300 rpm selama 20 menit didapat endapan putih ( pellet) yang terdapat pada bagian bawah tabung sentrifuga.

 Hal tersebut dikarenakan prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Prinsip presipitasi adalah pengendapan DNA agar terpisah dari zat lain yang terdapat dalam sel (Kimball 2005).

Sentrifugasi merupakan salah satu metode dasar yang Sangat penting dalam studi biologi sel maupun molekular. Sentrifugasi tidak hanya berguna untuk memisahkan sel atau organel subselular, melainkan juga digunakan untuk pemisahan molekular. Teknik sentrifugasi pada pengisolasian DNA berfungsi untuk memisahkan DNA dari zat lain dalam sel berdasarkan berat molekulnya. 

 Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan mengunakan alat yang berupa rotor yang digerakan oleh motor elektrik yang merupakan tempat berpegangnya tabung yang akan disentrifugasi. Pergerakan mesin sentrifugasi berhubungan dengan massa, kerapatan dan susunan dari molekul yang disentrifugasi, serta massa , kerapatan dan viskositas dari lingkungan larutan (Triwibowo, 2005). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell 2002).

Setelah supernatan diambil dan pellet ditambahkan 60 µL EDTA 50 mM, yang berfungsi sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuklease (Sudarsono, 1996). Lalu disentrifugasi kembali selama 15 menit dan pellet yang diperoleh ditambahkan 40 µL larutan sukrosa 25 % yang berfungsi untuk merusak sel dan 10,5 µL EDTA 0,5M pH 8 berfungsi untuk menghasncurkan dinding sel.

Kemudian ditambahkan 1,5 µL lisozim 10mg/ml yang berguna untuk pembuangan dinding sel dan inkubasi pada suhu 37⁰C selama 1 jam agar lisozim bekerja dengan optimal. Selanjutnya ditambahkan 18 µL NaCl 5M berfungsi untuk menggabungkan kembali pellet dengan lerutan yang telah ditambahkan; 10,5 µL EDTA 0,5 M berfungsi agar tidak terjadi koagulasi; 22,5 µL SDS 20% berfungsi untuk melisiskan membrane sel, dan 1,5 µL proteinase-k 5 mg/ml berfungsi sebagai enzim yang merusak protein, kemudian divortex agar homogen dan diinkubasi sediaan pada suhu 50 ⁰C selama 1 jam hal tersebut bertujuan untuk mengoptimalkan kerja enzim yang sangat dipengaruhi oleh temperatur.

 Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel. Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan dari awal isolasi DNA yang bertujuan untuk mengeluarkan isi sel (Holme dan Hazel, 1998). Fungsi dari penambahan proteinase K ini adalah untuk memotong-motong atau memutus ikatan peptida dari protein-protein sel bakteri tersebut, lalu campuran tersebut dikocok menggunakan vortex agar pemutusan ikatan-ikatan peptida tersebut lebih cepat terjadi.

Sementara SDS (sodium dodesil sulfat) berfungsi sebagai pendenaturasi protein untuk membuat protein tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif pada proses elektroforesis gel. Setelah itu ditambahkan kloroform dengan perbandingan (1:1) dan kocok pelan selama 20 menit dihasilkan dua lapisan yang dapat dilihat pada Tabel 4.1. hal tersebut dikarenakan kloroform berfungsi untuk mendenaturasi protein sehingga berdasarkan hasil pengamatan protein berada pada lapisan atas.   

Selanjutnya sentrifugasi dengan kecepatan 4300 rpm selama 30 menit didapatkan tiga lapisan yang dapat dilihat pada Tabel 4.1 yang lapisan atas yang diduga mengandung DNA, lapisan tengah merupakan protein dan lapisan bawah terdapat debris sel. Pindahkan supernatan (larutan yang terlihat bening) ke tabung baru yang berisi 2x volume etanol dingin. Fungsi dari penambahan etanol yaitu untuk mengikat strand DNA yang telah terkumpul.

 Strand-strand DNA yang terikat oleh etanol akan nampak sebagai benang-benang putih yang terapung diatas filtrat. Selain itu etanol juga berfungsi mempertifikasi DNA. Pemekatan dengan etanol pada lapisan atas sampel sehingga terjadi presipitasi DNA pada perbatasan kedualarutan. Etanol yang digunakan pada praktikum ini adalah etanol 50%. Pada saat penambahan etanol, larutan akan tampak terbalik untuk beberapa saat, dan pada akhirnya ethanol akan berada di bagian atas tabung, sementara filtrat berada dibagian dasar tabung karena etanol memiliki kerapatan yang lebih kecil dibandingkan air. 

Setelah itu sentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya ditambahkan pellet dengan 30 µL buffer TE, TE Buffer adalah campuran antara larutan Tris-HCl dengan EDTA pada konsentrasi tertentu. TE Buffer dalam praktikum biologi molekuler berfungsi untuk menstabilkan DNA atau RNA karena pH nya dijaga sekitar 8. Karena DNA dan RNA memiliki sifat asam lemah (DNA=asam deoksiribonukleat, RNA=asam ribonukleat), yang dalam waktu lama dapat menyebabkan degradasi DNA/RNA, sehingga dibuatlah TE Buffer tersebut.

Buffer TE berfungsi untuk melarutkan DNA yang dihasilkan dan menjaga DNA agar tidak mudah rusak dan simpan pada suhu -20⁰C. Berdasarkan hasil praktikum isolasi DNA plasmid dengan metode spin column DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. 

Bakteri yang digunakan untuk diambil plasmidnya adalah bakteri Escherchia coli dikarenakan: Mudah didapatkan, menghasilkan keturunan yang banyak dalam waktu yang singkat dan memiliki jumlah plasmid yang banyak. Beberapa teknik yang dapat digunakan untuk merusak sel Escherchia coli, untuk melepaskan molekul DNA plasmid. Metode yang digunakan pada isolasi DNA plasmid ini adalah metode spin column yaitu dengan  menggunakan PD.

Langkah pertama yang dilakukan pada isolasi DNA plasmid adalah mengambil 1,5 ml bakteri dalam kultur cair LB (laurienbertani broth) yang telah dipersiapkan dengan menggunakan mikropipet dan memasukkannya ke dalam tabung mikro 1,5 ml. Kemudian mengendapkan bakteri dengan microsentrifuge dengan kecepatan 14.000-16.000 rpm selam 1 menit sehingga terbentuk pelet dan supernatan.

 Prinsip-prinsip dari sentrifugasi adalah dengan memisahkan molekul berdasarkan ukuran dan berat molekul. Sampel yang disentrifugasi dengan kecepatan tinggi dan gaya sentrifugal menyebabkan komponen yang lebih besar dan lebih berat akan terendap di dasar tabung yang biasa disebut dengan pellet, sedangkan molekul yang ukuran dan beratnya lebih kecil akan berada pada lapisan yang atas yang biasa disebut dengan supernatan. 

Dalam hal ini, sel bakteri Escherchia coli akan berada pada pellet sehingga kita mengambil pelletnya dan membuang bagian supernatan. Tahap 2 yaitu Resuspension dengan menambahkan 200 µL buffer PD1 (pastikan RNAse A telah ditambahkan) kedalam tabung mikro yang berfungsi untuk menghancurkan RNA sehingga DNA dapat diisolasi secara utuh, kemudian divortex untuk menghomogenkan larutan. Tahap 3. Lysis dengan menambahkan 200 µL buffer PD2 ( pastikan pellet sudah larut dalam buffer PD1) yang berfungsi untuk melisiskan membran sel, kemudian bolak-balik tabung 10x dengan hati-hati (jangan gunakan vortex) yang berfungsi agar proses lisis berjalan sempurna, setelah itu inkubasi dalam suhu ruang minimal 2 menit.

 Tahap 4. Neutralization dengan menambahkan 300 µL buffer PD3 kemudian bolak-balik tabung 10x (jangan gunakan vortex) lalu sentrifuga pada 14.000-16.000x g selama 3 menit yang hasilnya dapat dilihat pada Tabel 4.2 Hal ini bertujuan untuk memisahkan kontaminan yang mungkin masih terdapat pada supernatan. Tahap 5. DNA binding dengan menempatkan PD column dalam 2ml collection tube kemudian tuang supernatan dari tahap 7, kemudian sentrifuga pada 14.000-16.000x g selama 30 detik. Lalu buang cairan pada 2 ml collection tube, kemudian pasang kembali PD column pada 2 ml collection tube.

Tahap 6. Wash dengan menambahkan 600 µL wash buffer (pastikan etanol telah ditambahkan)  Fungsi dari penambahan etanol yaitu untuk mengikat strandDNA yang telah terkumpul. Strand-strand DNA yang terikat oleh etanol akan nampak sebagai benang-benang putih yang terapung diatas filtrat. Selain itu etanol juga berfungsi mempertifikasi DNA. Pemekatan dengan etanol pada lapisan atas sampel sehingga terjadi presipitasi DNA pada perbatasan kedualarutan kedalam PD column kemudian sentrifuga pada 14.000-16.000x g selama 30 detik.

Lalu buang cairan dalam 2 ml collection tube cairan pada tabung kolektor yang berisi kontaminan hasil pencucian dibuang, lalu kolom diletakkan pada tabung kolektor yang sama, kemudian sentrifuga pada 14.000-16.000x g selama 3 menit untuk mengeringkan PD column. Teknologi Wash Buffer adalah sebuah formulasi optimal buffer dan garam yang memaksimalkan penyerapan antibodi dan antigen ke piring plastik.

 Selama proses adsorpsi, kinerjanya untuk menstabilkan protein yang terlapisi, memungkinkan untuk mengikat reaktivitas yang lebih besar dengan molekul deteksi, sehingga meningkatkan sinyal tertentu. Dengan menghasilkan sinyal tertentu yang lebih tinggi, konsentrasi yang lebih rendah dari protein mantel mungkin diperlukan ketika buffer ini digunakan, sehingga menghemat reagen yang berharga. Tujuan dari sentrifugasi ini adalah untuk mendapatkan pellet yang akan mengendap di dasar kolom.

Pada saat memasukkan kolom pada mikrosentrifuga yang berfungsi untuk memisahkan molekul menurut berat jenis, seharusnya dilakukan sentrifugasi dengan jumlah kolom yang berpasangan dan diletakkan sejajar berhadapan, hal ini untuk menyeimbangkan saat terjadi proses sentrifugasi dan pellet yang didapatkan pun akan lebih baik dibandingkan dengan sentrifugasi yang tidak berpasangan.  Campuran heterogen terdiri dari senyawa-senyawa dengan berat jenis berdekatan sulit dipisahkan.

 Membiarkan senyawa tersebut terendapkan karena adanya grafitasi berjalan sangat lambat. Salah satu teknik yang dapat dipergunakan untuk memisahkan campuran ini adalah teknik sentrifugasi, yaitu metode yang digunakan dalam untuk mempercepat proses pengendapan dengan memberikan gaya sentrifugasi pada partikel-partikelnya. Pemisahan sentrifugal menggunakan prinsip dimana objek diputar secara horizontal pada jarak tertentu.

 Apabila objek berotasi di dalam tabung atau silinder yang berisi campuran cairan dan partikel, maka campuran tersebut dapat bergerak menuju pusat rotasi, namun hal tersebut tidak terjadi karena adanya gaya yang berlawanan yang menuju kearah dinding luar silinder atau tabung, gaya tersebut adalah gaya sentrifugasi. Gaya inilah yang menyebabkan partikel-partikel menuju dinding tanbung dan terakumulasi membentuk endapan. Setelah itu, supernatan dalam tabung kolektor dibuang. Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih rendah.

Posisi dari substansi ini berada pada lapisan atas dan warnanya lebih jerbih. Sementara pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih tinggi. Posisinya berada pada bagian bawah (berupa endapan) dan warnanya lebih keruh. Lalu, kolom purifikasi ditempatkan kembali dalam tabung kolektor yang sama.

Tahap 7. DNA elution dengan menambahkan 50 µL buffer elusi ke bagian tengan PD column matrix, biarkan selama minimal 2 menit agar buffer elusi terserap sempurna, lalu sentrifuga pada 14.000-16.000 xg  selama 2 menit untuk mendapatkan DNA murni, setelah itu tuangkan kembali cairan dalam 2 ml collection tube ke bagian tengah PD column matrix dan sentrifuga pada 14.000-16.000 x g selama 2 menit untuk mendapatkan DNA murni.

  V.               Kesimpulan

Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat diambil kesimpulan bahwa, praktikan mampu melakukan isolasi DNA kromosomal bakteri Escherichia coli dengan cara penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Praktikan juga mampu melakukan isolasi DNA plasmid dengan metode spin column melalui tahapan Harvesting, Resuspension, Lysis, Neutralization, DNA binding, Wash dan DNA elution.

DAFTAR PUSTAKA

Ardiana, Dwi Wahyuni. 2009.Teknik Isolasi DNA Genom Tanaman Pepaya dan Jeruk dengan Menggunakan Modifikasi Bufer CTAB. Teknisi Litkayasa Nonkelas pada Balai Penelitian Tanaman Buah Tropika, Sumatera Barat. Buletin Teknik Pertanian Vol. 14 No. 1, 2009: 12-16.5hal

Giri, Rahman EA . 2004. Regulasi Ekspresi Gen Pada Organisme Bakteri. KPP Bioteknologi Bandung. Bandung

Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. jurusan Biologi FMIPA UM. Malang

Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Detergen, Penambahan Enzim, dan Ekstrak Nanas (Ananas comusus (L) Merr) Terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai Macam Buah Sebagai Topik Praktikum Matakuliah Genetika. Universitas Negeri Malang. Malang

Kimball. J. 2005.Biologi. ed. ke -5. jilid 1. terj dari Biology. 5th ed, oleh Prof. DR. Ir. H. Siti Soetarmi T. Erlangga. Jakarta: xiii + 333 hlm.

Listanto, E; pardal,s.j; Wang, k. 1996. Jurnal Bioteknologi Pertanian, Indonesian Journal of Agricultural Biotechnologi. Metode sederhana isolasi DNA  dari tanaman jagung transgenic untuk polymerase chain reaction. Balai penelitian Bioteknologi Tanaman Pangan. Bogor

Prasetyo, A. 2008. Karakterisasi virus pada tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.). Fakultas Pertanian Universitas Gadjah Mada. Skripsi.(Tidak Dipublikasikan). Yogyakarta

Barnum, 05 Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd edition. USA : Thomson Brooks/Cole

Triwibowo, Y. 2005. Biologi Molekular. Erlangga, Jakarta: xiii + 269 hlm

Utami,  Annisa.dkk .2012. Variasi metode isolasi DNA daun temulawak (cucurma xanthorrhiza). Prosiding seminar nasional kimia Unesa. Surabaya

Yuwono, Triwibowo.2006. Bioteknolgi Pertanian. Gadjag Mada University Press. Yogyakarta

Zubaidah, 2004.Isolasi dan karakterisasi Gen Perbaikan DNA Baru pada Bakteri Radioresisten Deinococcus radiodurans. Prosiding Seminar Nasional Sains dan Teknik Nuklir, Bandung.